La llegada del siglo XVI, el cuarto de la historia del Estudio salmantino, llevó a la Universidad de Salamanca a vivir su siglo de oro. Su influencia, sus estudiantes, sus cátedras y la creación de la conocida como Escuela de Salamanca harían de estos años unos de los más destacados para la institución académica.

Así, sería este siglo en el que la Universidad deja los locales catedralicios y los alquileres para pasar a impartir sus clases en instalaciones propias. Esto sería posible gracias a la culminación de las obras de las Escuelas Mayores, que terminaron de construirse en 1533, mientras que la 'Fachada Rica' se levantó en 1529. En estos mismos años, en 1532, se construyó también la fachada de las Escuelas Menores.

El despegue, crecimiento y consolidación de la Universidad de Salamanca ha quedado reflejado en los libros de matrícula de esos años, cuando se vivió un crecimiento exponencial durante toda la centuria. A principios del siglo XVI la Universidad contaba con alrededor de 2.500 alumnos, mientras que en el curso 1584/1585 ya pisaban las aulas salmantinas un total de 6.778 estudiantes. Una época en la que también hicieron historia las primeras mujeres en la Universidad, ya que fue la época en la que Beatriz Galindo pisó sus aulas y Lucía de Medrano se convertió en la primera mujer en impartir clases en la universidad.

El imparable crecimiento de alumnos también quedó reflejado en el importante volumen de estudios y cátedras ofertados por el Estudio salmantino. Hacia el año 1600 había ya un total de 26 cátedras vitalicias y unas 30 temporales agrupadas en un total de ocho áreas del saber como son Cánones, Leyes, Teología, Medicina, Artes-Filosofía, Humanidades-Lenguas, Matemáticas y Música. Todo ello para nutrir a la sociedad de licenciados en distintas materias.

La confluencia de un buen número de estudiantes y de una amplia oferta educativa trajo consigo la llegada de los primeros personajes destacados a la Universidad como Fray Luis de León y su famosa frase "decíamos ayer..." o Francisco de Vitoria, que encabezó la denominada Escuela de Salamanca, surgida hacia el año 1550. Esta escuela fue el trabajo de importantes pensadores y estudiantes que permitió renovar la teología de la época y sentar las bases del derecho de gentes, del derecho internacional y de la ciencia económica moderna.

También fue una época de cambios normativos con la aprobación de diferentes estatutos a lo largo de este siglo. El 15 de octubre de 1561 se aprobaron unos estatutos en los que se daba luz verde a una reforma parcial de la organización universitaria. Unas normas que quitaban la iniciativa al Papado para la elaboración de los estatutos en favor de la Monarquía y su consejo. Asimismo, antes de finalizar este siglo, en 1594 llegaría la aprobación de unos nuevos estatutos, que diseñan nuevos planes de estudios con nuevos libros, autores y materias. Posteriormente, en 1604 y en 1618 se aprobarían estatutos complementarios a este.

Todo ello le permitió a la Universidad de Salamanca convertirse en la Universidad más prestigiosa e influyente de España, algo que fue posible por la variedad de enseñanza, las mejores dotaciones con las que contaba y la presencia de alumnado internacional. Tanto es así que durante esta época los licenciados de la Universidad de Salamanca nutrieron de funcionarios a la administración del Estado y el Estudio sirvió como modelo y referente a las primeras universidades americanas, que comenzaron a fundarse a partir de 1551.